重度抑郁症(MDD)被定义为一种复杂的精神障碍，其特征是普遍的情绪低落和厌恶活动。几种类型的神经递质系统，如血清素能、谷氨酸能和去甲肾上腺素能系统，已被认为在抑郁症的起源中起重要作用，但神经营养物质，如脑源性神经营养因子(BDNF)也与疾病过程有关。
本研究的目的是研究一类新开发的分子，其特征是神经营养因子/Trk受体介导的信号(Trk- pam)的正变构调节剂，对体内神经递质释放和抑郁样行为的影响。
利用新开发的Trk- pam化合物(ACD855、ACD856和AC26845)以及氯胺酮和氟西汀在啮齿动物强迫游泳试验(FST)中研究了神经营养因子/Trk信号通路与血清素和谷氨酸能系统在调节抑郁相关反应中的作用及其可能的相互作用。此外，在自由活动的大鼠体内进行微透析，以评估大鼠神经递质水平的变化。
研究结果表明，几种不同的化合物都能增强trk受体介导的信号传导，在FST中显示出类似抗抑郁的活性。此外，数据还表明氟西汀和氯胺酮在FST中的作用，都是通过BDNF/TrkB信号介导的，这可能对MDD的新疗法有影响。
trk - pam可以为这一领域的新疗法的开发提供一个有趣的途径。
临床抑郁症或重度抑郁症(MDD)是影响情绪的几种精神疾病之一，还有躁狂、轻躁狂和双相情感障碍。抑郁症被定义为一种常见的复杂精神疾病，其特征是普遍的低和持续的抑郁情绪，兴趣下降和自杀意念。抑郁症是一种危及生命的精神疾病，也是世界范围内的一个主要公共卫生问题，发病率为5%，终生患病率为15-20% (Kessler et al. 2005)。此外，抑郁症与残疾、生活质量下降、健康相关费用增加有关，并被认为是许多疾病的主要风险因素，包括心血管、代谢和神经精神疾病(Cryan和Holmes, 2005年;Thase 2006)。虽然目前可用的抗抑郁药提供了可测量程度的治疗缓解，但大约50%被诊断为重度抑郁症的个体对使用传统抗抑郁药进行一线治疗(治疗抵抗性重度抑郁症患者)没有充分反应(Trivedi et al. 2006;Fava et al. 2008)。目前的药物治疗方法疗效有限，并伴有许多有害的副作用(Dording等，2002;Lam and Kennedy 2004)。此外，对于持续有自杀意念的患者，延迟3 - 4周的治疗效果尤其困难。因此，迫切需要开发能够立即缓解抑郁症状的快速抗抑郁药，并将其作为抗抑郁药持续发挥作用，用于治疗对传统疗法无反应的耐药患者。更好地了解这种疾病的病理生理学以及创新和改进的治疗方法的发展仍然至关重要。因此，动物模型对于推进这一领域的研究至关重要，由于现有治疗方法的疗效有限且副作用大量，筛选新型抗抑郁药是现代研究的重要实践(Kessler et al. 2003;Licinio and Wong 2005)。
抑郁症发病机制的一个主流假说是单胺假说，该假说预测抑郁症的潜在病理生理基础是中枢神经系统中单胺(血清素、去甲肾上腺素、多巴胺)水平的降低。然而，最近的数据表明，生物胺水平的不平衡，如多巴胺(DA)和血清素(5-HT)，与精神分裂症和抑郁症等精神疾病的病因有关(Sánchez et al. 2010;shghendo and Mifsud 2012;cz
等人，2016)。多巴胺能和血清素能系统的这些不平衡反过来又可能影响整个神经递质系统内的化学平衡(Qi et al. 2013;2016)。此外，许多研究表明，这种假设的病理生理学似乎得到了抗抑郁药作用机制的支持:改变大脑中单胺水平的药物都被证明对减轻抑郁症状有效。因此，治疗抑郁症的疗法是针对单胺能系统的，其中大多数是专门针对血清素系统的，血清素浓度升高是一种常见的效果。尽管一些证据表明中枢神经系统中血清素能系统的改变可能是抑郁症病理生理学的基础(Mann 1999;Mikael et al. 2018)一半的MDD患者对选择性5 -羟色胺再摄取抑制剂(SSRI)治疗无效，这是一线药物治疗。此外，对于SSRI等抗抑郁药，在开始治疗和显著抗抑郁效果之间存在数周的滞后时间(Gelenberg and Chesen 2000)。
越来越多的证据也表明，谷氨酸能神经传递在神经生物学和重度抑郁症的治疗中起着重要作用(Berman et al. 2000;Zarate et al. 2006;Mathew et al. 2012)。事实上，临床研究已经证明，非竞争性n-甲基-d-天冬氨酸(NMDA)受体拮抗剂氯胺酮对治疗难耐的MDD患者具有快速的抗抑郁作用(Diazgranados等，2010)。然而，由于存在严重的副作用，包括解离效应、镇静和恶心，它在一些国家仅作为三线治疗使用。
神经营养因子、脑源性神经营养因子(BDNF)和神经生长因子(NGF)是引起越来越多关注的替代机制和治疗方法。神经营养因子是大脑中一个密切相关的蛋白质家族，它有助于神经元的存活、生长和维持(Cowansage et al. 2010)，并参与多种大脑功能，如抑郁、学习和记忆(Ahlskog et al. 2011;Lee and Kim 2010)。哺乳动物神经营养因子包括BDNF、神经生长因子、神经营养因子3和神经营养因子4/5。毫无疑问，大多数将神经营养因子与抑郁症联系起来的文献都涉及到BDNF的研究，事实上，有一个完善的临床证据表明BDNF参与抑郁症的病理生物学(Lee和Kim 2010)。抑郁症患者血清和血浆中成熟BDNF的外周减少已被发现(Lee et al. 2007;吉田等人，2012)和自杀案例(Birkenhager等人，2012;Kim et al. 2007)。一项荟萃分析和系统评价的结果显示，与健康对照组相比，未服用抗抑郁药的重度抑郁症患者血清BDNF水平显著降低(Molendijk et al. 2014)。此外，血清BDNF水平在几种抗抑郁药治疗后趋于正常化，如舍曲林、艾司西酞普兰或文拉法辛(Matrisciano等人，2009)、电休克治疗(Brunoni等人，2014)和体育锻炼(Engesser-Cesar等人，2007)。
有趣的是，一些证据也表明，BDNF对氯胺酮和SSRI类药物(如氟西汀)的抗抑郁反应是必需的。临床前研究发现，将BDNF中和抗体输注到mPFC中可以消除氯胺酮的抗抑郁样作用，这也表明mPFC中的BDNF可能是一个重要的作用位点(Lepack et al. 2014)。小鼠表达人BDNF val66met多态性(导致BDNF分泌降低;Egan et al. 2003)在急性氯胺酮给药后进行了检查，结果显示抗抑郁反应减弱(Liu et al. 2012)，这表明氯胺酮的快速抗抑郁作用需要功能性BDNF。基本上所有抗抑郁药，包括氯胺酮和SSRI类药物，也通过其受体酪氨酸激酶受体B (TrkB)增加脑源性神经营养因子(BDNF)的表达和信号传导(Autry and Monteggia 2012;castr
和安提拉2017;Duman and Monteggia 2006)。此外，BDNF在啮齿动物中模仿抗抑郁药的作用，抑制TrkB信号传导已被证明可以防止其行为影响(Duman和Monteggia 2006;sarelainen et al. 2003)。SSRIs和氯胺酮对BDNF信号传导的影响被认为是间接的，分别通过抑制血清素转运体(5HTT)和NMDA受体。然而，最近的数据表明，氯胺酮和氟西汀等SSRI都可以直接与trkb受体结合，介导其抗抑郁作用(Casarotto et al. 2021)。
使用直接增强神经营养蛋白信号的小分子治疗是一种不太可能受到使用神经营养蛋白本身固有缺点的机制，包括昂贵且有时复杂的治疗，血浆半生期短，注射部位局部不良事件，以及无法通过血脑屏障[27]。人们已经尝试鉴定和开发神经营养因子信号传导的小分子激活剂，包括肽学[28-35]、具有激动性的小分子如7,8-二羟黄酮[36]、麻草酰胺[37]、阿米替林[38]、LM22A[39]、AIT-082[40,41]、L-783,281及其类似物[42,43]、MT-2[44]、大环化合物如NG-011和NG-012[45]、各种天然产物[46]、以及几种天然和合成的含有类固醇骨架的物质[47-49]。然而，到目前为止，很少有化合物达到临床开发阶段。
在我们试图识别能够影响神经营养因子信号传导的小分子时，我们已经确定了一类新的化合物作为trk受体的正变构调节剂(PAM)，增强内源性配体(如BDNF和NGF)的信号传导。在几种不同的动物行为模型中，这些化合物已被证明可以增强突触可塑性，并以trkb受体依赖的方式减弱认知功能障碍，包括被动回避模型、水迷宫和物体识别任务(Dahlstr?m et al. 2021)。在这种新型化学类别中开发的第一个分子是ACD855，由于在人体中的半衰期长而停产。随后的化合物ACD856最近完成了I期临床试验，AC-0026845是一种处于研究阶段的发现化合物。尽管这些化合物在体外实验中在结构和药理学上非常相似，但使用多种物理化学和药代动力学性质略有不同的Trk-PAM化合物被认为是合适的，可以更好地描述这类新分子的潜在抗抑郁样作用。
本研究旨在探讨不同PAM的trk受体在fst诱导的啮齿动物抑郁样行为中的作用。在这里，我们使用了几种Trk-PAM的化合物ACD855、ACD856、AC26845以及TrkB拮抗剂ANA-12作为药理工具(Cazorla et al. 2011)。我们使用体内微透析检查了这些化合物对抑郁样行为和脑神经递质水平的影响。此外，还评估了Trk-PAM化合物与氯胺酮或氟西汀在调节抑郁样行为中的潜在相互作用。
实验采用德国Charles River的成年雄性C57BL/6 J小鼠。试验时小鼠为7-8周龄，体重为25-30克。实验动物以4-6只为一组，饲养在标准Macrolon?笼(A3, 42 × 26x20 cm)中，室温和湿度控制(21±1℃，60±5%湿度)，光照/暗循环12小时(早上6点开灯)，可自由使用标准实验饲料(Ewos R36, Ewos AB, S?dert?lje，瑞典)，并提供自来水。在实验前，让动物适应维护设施至少7天。实验前1小时将动物转移到实验室内进行适应，所有动物由一名研究人员处理和测试。所有的实验都是在浅色阶段(上午9点到下午3点)的实验性na?ve动物中进行的，所有的努力都是为了减少动物的痛苦和使用的动物数量。笼子一周换一次。动物住房和实验程序遵循瑞典动物保护立法的协议和建议。实验程序经当地动物伦理委员会(ID 1640)批准，符合欧洲理事会指令(2010/63/EU)。
以雄性弗林德斯敏感系(FSL)大鼠为研究对象。这种选择性培育的大鼠品种源于Sprague-Dawley品种，与严重抑郁症的独特行为和神经化学特征有关，包括一些具有面部有效性的特征，例如精神运动迟缓和快速眼动睡眠增加。FSL大鼠表现出对环境压力源的遗传易感，并已成功用于抗抑郁效果的验证(Overstreet et al. 2005)。这些动物是在卡罗林斯卡学院生理和药学系饲养的，并在2-4个月大时进行了测试。将大鼠置于标准笼(TypeIV Macrolon, Bayer Material Science，勒沃库森，德国，26 × 42 × 15 cm)中，室温，相对湿度(45-55%)，恒定光/暗循环(06.00 h开灯)。水和食物颗粒(LactaminR36，瑞典，斯德哥尔摩)可随意取用。FSL大鼠随机分为氟西汀组、ACD855组、ACD856组和载药组。
微透析实验在Pronexus AB, Bromma，瑞典(伦理许可N24/14)进行，实验对象为清醒、可自由活动的雄性Sprague Dawley大鼠(n=6, 7-8周龄，来自法国Le Genest-Saint-Isle的Janvier实验室)。将大鼠置于受控环境(22±1℃;45-50%湿度)，12小时暗/12小时明(40勒克斯)循环。在整个饲养期间和微透析实验期间，大鼠可以自由使用标准实验室饲料(RM1A(P)， SDS, Scanbur，瑞典)和自来水。在研究开始之前，对大鼠进行了检查和称重，以确保足够的健康和适宜性。
ACD855、ACD856和AC-0026845由AlzeCure Pharma提供，与ANA 12 (Tocris)一样，溶解在0.1 M磷酸盐缓冲(PBS)中20%二甲基亚砜(DMSO)中。s-氯胺酮(Sigma-Aldrich，斯德哥尔摩，瑞典)和盐酸氟西汀(Sigma-Aldrich，斯德哥尔摩，瑞典)溶解在盐水中。ACD855和ACD856的背景数据请参见Dahlstr?m et al.(2021)。与ACD855和ACD856相同，AC-0026845在TrkB、TrkA和TrkC上的IC50分别为106 nM、196 nM和150 nM。所选择的剂量是基于化合物的已知药代动力学。所有药物均以8ml /kg的体积在颈背处腹腔(i.p.)或皮下(s.c.)注射。所有药物均急性给药(单次给药)或重复给药(每日一次)，连续4天或28天，最后一次注射在实验前30-60分钟进行。
FST是测量啮齿动物抑郁样行为最常用的行为测试(Porsolt et al. 1977,1978)。放在装有水的圆柱体中的动物很快就会变得不能动，表现为被动地漂浮或只做必要的运动来保持漂浮。基于不可避免的压力暴露引起的不动反应，FST也具有很强的预测有效性，因为短期服用各种药理学类的抗抑郁化合物可以减少FST中的不动时间。
如前所述，使用改良版的FST对小鼠和大鼠进行抑郁样行为评估(Kuteeva et al. 2005)。这包括一个为期两天的方案测试，在测试前24小时(FST的第一天)预先接触水，这似乎是一种比单次接触(一天测试)的标准方法更准确和敏感的检测小鼠抑郁样行为的技术(Kuteeva等人，2005;Porsolt et al. 1977;Dalvi and Lucki 1999)。动物被单独放置在一个垂直的玻璃圆柱体中(高50厘米，直径20厘米，CMA)，圆柱体中装满了35厘米(25±0.5°C)的自来水。进行两次游泳训练:第一天进行10分钟的预试，24小时后(第二天)进行6分钟的测试。在6分钟的测试中，记录静止的总持续时间以及到第一次静止的潜伏期。每次游泳结束后，将老鼠轻轻地移出，与干餐巾一起放在家庭笼子里。不动被定义为在水中被动地以直立的姿势漂浮，只有微小的运动才能使头部保持在水面以上。漂浮时间被认为是抑郁样行为的一个指标。每只动物之间的玻璃缸都被彻底清洗干净。
微透析实验在Pronexus AB, Bromma, Sweden(伦理许可N24/14)进行，实验用的是先前描述的清醒、自由活动的雄性Sprague Dawley大鼠(Kehr et al. 1998;Yoshitake et al. 2004)。
简单地说，用异氟醚麻醉大鼠，将其置于立体定位框架中，在以下坐标处将引导套管(Eicom Corp.， Kyoto, Japan)植入海马:AP-5.2 mm, L + 5.0 mm, V-2.8 mm，为微透析探针的尖端提供最终的-6.8 mm。使用牙水泥(Dentalon Plus, Heraeus Instruments, Hanau, Germany)将引导套管牢固地固定在颅骨表面，缝合头皮切口，让动物恢复一周。
在微透析实验当天，将其饲养的大鼠放入旋转动物笼系统RACS (Microbiotech/se， ?rsta，瑞典)的框架中。RACS允许将微透析管与每个注射泵和馏分收集器进行无旋转连接，同时对运动激活进行简短记录。将微透析探针(Eicom A- i: 0.22 mm od, 4 mm膜长，截止50 kDa)插入清醒大鼠的引导管内。探针用氟化乙丙烯(FEP)管(0.1 mm id)连接到RACS系统的平衡臂上。用人工脑脊液(aCSF: 148 mM NaCl, 4 mM KCl, 0.8 mM MgCl2, 1.4 CaCl2, 1.2 mM Na2HPO4, 0.3 mM NaH2PO4, pH 7.2)以1 μl/min的恒定流速灌注探针。每只大鼠被允许适应新环境120至150分钟。在这段稳定期之后，每隔30分钟收集微透析样品。采集前3个样本，测定细胞外神经递质基础水平。随后，给药ACD856或代药制剂，并再收集24小时样品。实验结束后，通过过量异氟醚和颈部脱臼处死动物。快速取出大脑，在干冰上快速冷冻，并在-80°C下保存，用于组织生物标志物的额外分析和微透析探针放置的组织学验证。
微透析样品中乙酰胆碱(ACh)和谷氨酸(Glu)的浓度采用超高效液相色谱串联质谱法(UHPLC-MS/MS)测定，而微透析样品中单胺类多巴胺(DA)、去甲肾上腺素(NA)和5-羟色胺(5-HT)的浓度采用离子交换窄孔柱液相色谱法与电化学检测相结合测定，详见其他文献(Kehr et al. 1998,2007;Yoshitake et al. 2004)。
结果采用单因素方差分析(ANOVA)进行分析，治疗作为组间因素。如果有显著性，则采用Tukey多重比较检验来评估组间的统计学差异。只有两组的实验采用非配对学生t检验。显著性水平设为0.05。该研究被设计为受试者(独立组)之间的实验(即每只动物仅使用一次)。在相关的情况下，采用双向方差分析来评估组合治疗的潜在协同效应。使用graphpad Prism进行统计并绘制相应的图表。数据以平均值±平均值的标准误差(SEM)报告。
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单次和多次注射Trk-PAM ACD855对小鼠抑郁样行为的影响如图1所示。使用单因素方差分析(单因素方差分析)观察到单一治疗对不活动时间(被认为是抑郁的一个指标)的总体统计学显著影响(F(2,15)=13.93;p < 0.001)。事后分析显示，与对照组小鼠相比，单次注射3 mg/kg ACD855的小鼠的不动时间明显缩短(图1a, p < 0.01)。对照组小鼠的平均静止时间为304 s，而ACD855处理小鼠的平均静止时间为234 s。单剂量的选择性血清素再摄取抑制剂(SSRI)氟西汀(20mg /kg)治疗小鼠也显示出类似的结果，其静止时间(197 s)明显低于对照小鼠(图1a, p < 0.001)。
图1
服用ACD855后强迫游泳试验的抗抑郁样作用。强迫游泳试验采用10分钟的预试(第1天)，24小时后(第2天)进行6分钟的测试，记录不动状态。给小鼠注射单剂量ACD855 (3mg /kg, s.c;组a)行为试验前第2天或重复给药(每日1次;3 mg/kg/天，s.c)连续4天或28天(分别为b组和c组)，并与行为试验前第2天接受载体或单剂量20 mg/kg氟西汀治疗的小鼠进行比较。氟西汀与ACD855比较(p < 0.01);p < 0.001;P < 0.0001)显著减少了小鼠在强迫游泳试验中的静止时间。柱状图表示静止时间(秒)，平均值±SEM (n=6-8只/组)。统计学分析采用单因素方差分析，后加Tukey检验(面板A和B)或未配对t检验(C)。**p < 0.01;***p < 0.001;****与对照组相比p < 0.0001
单因素方差分析显示，ACD855重复给药4天或28天对静止时间的影响具有统计学意义(F (3,23)=17.90;p < 0.0001和p < 0.0001，未配对t检验)。事后分析显示，连续4天每天注射3 mg/kg/天ACD855的小鼠，或连续28天每天注射3 mg/kg/天的小鼠，与对照组小鼠相比，其静止时间显着缩短(图1b;P < 0.0001，分别为3 mg/kg后4天;3 mg/kg/天，连续28天p < 0.0001，图1c)。
单次和多次注射Trk-PAM ACD856对小鼠抑郁样行为的影响如图2所示。单次注射对静止时间的影响总体上具有统计学意义(F(4,25)=19.30;p < 0.0001)。事后分析显示，与对照组小鼠相比，单次注射1 mg/kg ACD856的小鼠的不动时间明显缩短(图2a, p < 0.001)。对照组小鼠的平均静止时间为305 s，而ACD856 (1 mg/kg)处理小鼠的平均静止时间为245 s。在用高剂量ACD856(10和50 mg/kg;p < 0.001;数据未显示)。选择性5 -羟色胺再摄取抑制剂(SSRI)氟西汀(20mg /kg)与对照小鼠相比，可显著减少静止时间(209 s)(图2a, p < 0.0001)。
图2
服用ACD856后强迫游泳试验的抗抑郁样作用。强迫游泳试验采用10分钟的预试(第1天)，24小时后(第2天)进行6分钟的测试，记录不动状态。小鼠分别注射单剂量ACD856(0.1、0.3和1 mg/kg, s.c);组a)行为试验前第2天或重复给药(每日1次;1 mg/kg/天，s.c)在行为试验前持续4天和28天(分别为b组和c组)，并与在行为试验前第2天给药的小鼠或单剂量20 mg/kg氟西汀进行比较。氟西汀(p < 0.0001)和ACD856 (p < 0.001);0.0001)显著减少了小鼠在强迫游泳试验中的静止时间。柱状图表示静止时间(秒)，平均值±SEM (n=6-8只/组)。统计分析采用单因素方差分析，然后进行Tukey检验(A组和B组)或unpaired t检验(C组)。***p < 0.001;****与对照组相比p < 0.0001
在小鼠FST中，也评估了ACD856 (1 mg/kg)连续4天或28天注射的效果。通过单因素方差分析，观察到治疗对静止时间的总体统计学显著影响(F (2,20)=25.93;p < 0.0001和p < 0.0001，未配对t检验)，分别注射后4天和28天。事后分析显示，与对照组小鼠相比，每天注射1 mg/kg/天剂量的ACD856连续4天或28天的小鼠表现出明显更短的不活动时间(图2b;p < 0.0001;1 mg/kg后4天)和(图2c;1 mg/kg/天，连续28天P < 0.001，)。
FSL大鼠被随机分为两组，一组是单次注射氟西汀(20 mg/kg, i.p)，另一组是每天重复注射ACD855 (3 mg/kg, s.c)或ACD856 (1 mg/kg, s.c)，连续4天。通过单因素方差分析，观察到治疗对静止时间的总体统计学显著影响(F (3,27)=3.91;p=0.0194)。事后分析显示，连续4天每日注射ACD855 (3 mg/kg/天)和ACD856 (1 mg/kg/天)的大鼠与对照动物相比，静止时间显著缩短(p < 0.05;图3)试验前30分钟单次注射氟西汀(20 mg/kg, i.p.)未能对FSL大鼠强制游泳试验中的不动性产生任何显著影响(p=0.312, n.s.)(图3)。
图3
ACD855、ACD856和氟西汀在强迫游泳试验中的抗抑郁样作用。强迫游泳试验采用10分钟的预试(第1天)，24小时后(第2天)进行6分钟的测试，记录不动状态。FSL大鼠在行为试验前重复(4天)给药ACD856 (1 mg/kg/day, s.c)、ACD855 (3 mg/kg/day, s.c)，或在行为试验前第2天单次给药氟西汀(20 mg/kg, i.p)，并与对照动物进行比较。与对照组相比，ACD855和ACD856显著减少了强迫游泳试验中大鼠的静止时间(p < 0.05)。柱状图表示静止时间(秒)，平均值±SEM (n=7-8只/组)。统计分析采用单因素方差分析和Tukey检验。*p < 0.05
单次注射Trk-PAM AC-0026845(0.3和1 mg/kg, s.c)单独或与低剂量ANA-12 (0.5 mg/kg, s.c)联合对小鼠抑郁样行为的影响如图4a所示。通过双因素方差分析，观察到单次给药对静止时间的总体统计学显著影响(F(3,28)=7.135;p < 0.01)。事后分析显示，单次注射AC-0026845 (1 mg/kg)的小鼠与对照组相比，静止时间显著缩短(p < 0.01;图4)小鼠在AC-0026845 (1 mg/kg)前30 min给予急性单剂量ANA-12，可显著阻断AC-0026845的抗抑郁样作用(p < 0.05;图4)。双向方差分析也显示两种治疗之间存在显著的相互作用(F(1,28)=15.08;p < 0.01)。
图4
AC-0026845和ANA-12在强迫游泳试验中的抗抑郁样作用。强迫游泳试验采用10分钟的预试(第1天)，24小时后(第2天)进行6分钟的测试，记录不动状态。小鼠在行为试验前第2天注射单剂量AC-0026845(0.3和1 mg/kg, s.c)或AC-0026845 (1 mg/kg, s.c)和ANA-12 (0.5 mg/kg, s.c, a组)或不同剂量的ANA-12(0.5和1 mg/kg, s.c, b组)，并与对照小鼠或单剂量AC-0026845处理的小鼠进行比较。AC-0026845在0.3和1 mg/kg时显著减少了静止时间(p < 0.05);0.01)。在AC-0026845 (1 mg/kg)前30 min给药ANA-12 (0.5 mg/kg)完全阻断其抗抑郁样活性(P < 0.05)。在上述剂量下，ANA-12未引起静止时间的显著减少(p=0.139, ns)。柱状图表示静止时间(秒)，平均值±SEM (n=8 /组)。统计分析分别采用双向方差分析(图4a)和单向方差分析(图4b)，然后进行Tukey检验。*P < 0.05， ** P < 0.01;与ac -0026845处理的小鼠相比，p < 0.05
急性单次注射不同剂量的ANA-12(0.5和1 mg/kg)对静止时间没有显著影响(p=0.139, ns;图4 b)。
单次注射SSRI氟西汀(5、10和20 mg/kg, i.p)单独或与亚阈剂量AC-0026845 (0.1 mg/kg, s.c)联合对小鼠抑郁样行为的影响如图5所示。通过单因素方差分析，观察到急性治疗对静止时间的总体统计学显著影响(F(3,20)=15.45;p < 0.0001)。事后分析显示，与对照组小鼠相比，单次注射氟西汀的小鼠的静止时间显著缩短(p < 0.05;0.000，分别在10和20 mg/kg后;图5)。氟西汀(10 mg/kg)和AC-0026845 (0.1 mg/kg)对小鼠抑郁样行为的联合作用如图5b所示。采用双因素方差分析(two-way ANOVA)观察到急性治疗对静止时间的总体统计学显著影响(F(3,26)=11.24;p < 0.0001)。事后分析显示，与对照组小鼠相比，单次注射氟西汀(10 mg/kg)小鼠的不动时间显著缩短(p < 0.05;图5 b)。有趣的是，氟西汀(10 mg/kg)和亚阈值剂量AC-0026845 (0.1 mg/kg)联合给药，与对照小鼠、氟西汀和AC-0026845相比，可显著减少静止时间(p < 0.001);p < 0.05 vs氟西汀，p < 0.05 vs AC-0026845)。然而，双向方差分析并未显示显著的相互作用(F(1,26)=1.6;ns)。
图5
不同剂量氟西汀在强迫游泳试验中的抗抑郁样作用。强迫游泳试验采用10分钟的预试(第1天)，24小时后(第2天)进行6分钟的测试，记录不动状态。小鼠在行为试验前第2天分别注射急性单剂量氟西汀(5、10和20 mg/kg, i.p)，或同时注射氟西汀(10 mg/kg, i.p)和AC-0026845 (0.1 mg/kg, s.c)，并与对照组小鼠或单剂量氟西汀(10 mg/kg)或AC-0026845 (0.1 mg/kg)小鼠进行比较。氟西汀剂量为5、10和20 mg/kg时，10和20 mg/kg组小鼠的静止时间显著减少(图5a, p < 0.05;P < 0.0001)。与对照组、AC-0026845 (0.1 mg/kg)或氟西汀(10 mg/kg)单独给药相比，亚阈剂量AC-0026845 (0.1 mg/kg)联合氟西汀(10 mg/kg)可显著减少静止时间(图5b, p < 0.01, p < 0.05;P < 0.05)。柱状图表示静止时间(秒)，平均值±SEM(每组n=6只)。统计分析分别采用单因素方差分析(图5a)和双因素方差分析(图5b)，并进行Tukey检验。*p < 0.05;****p < 0.001vs对照组;与氟西汀治疗小鼠相比，p < 0.05;§p < 0.05vs AC-0026845处理小鼠
急性注射NMDA受体拮抗剂氯胺酮(2.5、5和10 mg/kg, i.p.p)及其联合AC-0026845 (0.1 mg/kg, s.c.c)对小鼠抑郁样行为的影响如图6所示。通过单因素方差分析，观察到急性治疗对静止时间的总体统计学显著影响(F(3,26)=5.98;p < 0.01)。事后分析显示，与对照组小鼠相比，单次注射氯胺酮的小鼠在10 mg/kg后，其不动时间显著缩短(p < 0.01);图6 a)。亚阈剂量氯胺酮(5 mg/kg)和AC-0026845 (0.1 mg/kg)对小鼠抑郁样行为的联合作用如图6b所示。采用双因素方差分析(two-way ANOVA)观察到急性治疗对静止时间的总体统计学显著影响(F(3,28)=5.29;p < 0.01)。事后分析显示，单独注射氯胺酮(5 mg/kg)和AC-0026845 (0.1 mg/kg)的小鼠对静止时间都没有显著影响(p=0.807;分别为0.993,n.s.s)。有趣的是，与对照组和AC-0026845处理小鼠相比，非有效剂量氯胺酮(5 mg/kg)和AC-0026845 (0.1 mg/kg)联合施用可显著减少静止时间(与对照组相比p < 0.05，与AC-0026845处理小鼠相比p < 0.05，图6b)。然而，双向方差分析并未显示显著的相互作用(F(1,28)=2.8;ns)。
图6
不同剂量氯胺酮在强迫游泳试验中的抗抑郁样作用。强迫游泳试验采用10分钟的预试(第1天)，24小时后(第2天)进行6分钟的测试，记录不动状态。小鼠在行为试验前第2天注射急性单剂量氯胺酮(2.5、5和10 mg/kg, i.p)，或同时注射亚阈剂量氯胺酮(5 mg/kg, i.p)和AC-0026845 (0.1 mg/kg, s.c)，并与车辆处理小鼠和单剂量氯胺酮(5 mg/kg)或AC-0026845 (0.1 mg/kg)处理小鼠进行比较。与对照小鼠相比，剂量为2.5、5和10 mg/kg的氯胺酮显著减少了10 mg/kg的静止时间(图6a, p < 0.01)。与对照组和AC-0026845处理小鼠相比，AC-0026845 (0.1 mg/kg)联合氯胺酮(5 mg/kg)可显著减少小鼠的静止时间(图6b, P < 0.05;P < 0.05)。柱状图表示静止时间(秒)，平均值±SEM (n=7-8只/组)。统计分析分别采用单因素方差分析(图6a)和双因素方差分析(图6b)，并进行Tukey检验。*p < 0.05;与AC-0026845处理小鼠相比，p < 0.05
急性注射氯胺酮(10mg /kg, i.p.p)或氟西汀(20mg /kg, i.p.p)及其与ANA-12 (0.5 mg/kg, s.c.c)对小鼠抑郁样行为的影响如图7所示。单因素方差分析发现，急性治疗ANA-12和氯胺酮对静止时间的影响具有统计学意义(F(2,19)=9.222;p < 0.01)。事后分析显示，与对照组小鼠相比，单次注射氯胺酮(10 mg/kg)小鼠的静止时间显著缩短(p < 0.01;图7 a)。早于氯胺酮30 min给药小鼠急性单剂量ANA-12显著阻断氯胺酮(10 mg/kg)的抗抑郁样作用(p < 0.05;图7 a)。在氟西汀(20mg /kg)前30分钟急性注射ANA-12 (0.5 mg/kg)对小鼠抑郁样行为的影响如图7b所示。通过单因素方差分析，观察到急性治疗对静止时间的总体统计学显著影响(F (2,21)=8.324;p < 0.01)。事后分析显示，与对照组小鼠相比，单次注射氟西汀(20 mg/kg)小鼠的不动时间显著缩短(p < 0.01;图7 b)。ANA-12在氟西汀治疗前30 min显著阻断氟西汀(10 mg/kg)的抗抑郁样作用(p < 0.05;图7 b)。
图7
ANA-12对强迫游泳试验中氯胺酮和氟西汀抗抑郁样活性的影响。强迫游泳试验采用10分钟的预试(第1天)，24小时后(第2天)进行6分钟的测试，记录不动状态。小鼠在行为试验前第2天注射单剂量氯胺酮(10mg /kg, i.p)或氟西汀(20mg /kg, i.p)，或与ANA-12 (0.5 mg/kg, s.c)联合注射，并与对照组小鼠或单剂量氯胺酮(10mg /kg)或氟西汀(20mg /kg)治疗小鼠进行比较。与对照组小鼠相比，氯胺酮浓度为10 mg/kg时可显著减少小鼠的静止时间(图7a, p < 0.01)。在氯胺酮(10 mg/kg)之前30分钟给药ANA-12 (0.5 mg/kg)完全阻断其抗抑郁样活性(图7a, P < 0.05)。与对照组相比，氟西汀(20mg /kg)可显著减少小鼠的静止时间(图7b, p < 0.01)。同样，在氟西汀之前30分钟给药ANA-12 (0.5 mg/kg)，完全阻断其抗抑郁活性(图7b, p < 0.05)。柱状图表示静止时间(秒)，平均值±SEM (n=7-8只/组)。统计分析采用单因素方差分析和Tukey检验。**p < 0.01vs对照;与氯胺酮或氟西汀治疗的小鼠相比，p < 0.05
急性给药ACD856对微透析液中NA、DA、5-HT、Glu和ACh细胞外浓度的影响如图8a和8b所示。结果显示，ACD856对不同单胺类药物的相对AUC(0 ~ 120 min)值有明显升高趋势，处理后前2 h 5-HT水平显著高于对照组(P < 0.05)。对5-羟色胺释放的影响是迅速的，在前30分钟样品中水平已经增加到184% (P < 0.001)。在给药后60分钟，NA水平的最大增幅为139%，而DA水平的增幅稍慢，峰值效应为151%，出现在90分钟。ACD856的作用是短暂的，给药后2小时，所有三种单胺的水平都恢复到基础水平。ACD856对细胞外乙酰胆碱和谷氨酸水平无显著影响。
图8
ACD856对海马神经递质释放的影响。大鼠单次注射ACD856 (10 mg/kg) s.c.，微透析法连续测定血清素(5-HT)、去甲肾上腺素(NA)、多巴胺(DA)、乙酰胆碱(ACh)和谷氨酸(Glu)的释放。通过a) AUC(0-120分钟)值测量血清素的量显著增加，而b)中更详细的分析显示快速和短暂的效果。去甲肾上腺素和多巴胺在AUC中未达到显著性(a)，但在60-90分钟时间点显示显著性升高(b)。ACD856对细胞外乙酰胆碱或谷氨酸水平未见显著影响(数据未显示)。统计分析分别采用单向(图8a)和双向重复测量方差分析(图8b)，并进行Bonferroni多重比较检验。
临床抑郁症的主要症状是情绪变化，这使得很难建立临床抑郁症的动物模型(Fazer and Morilak 2005)。然而，基于压力刺激暴露的不同抑郁样行为的各种测试已经开发出来，包括习得性无助模型(Seligman et al. 1980)， FST (Porsolt et al. 1977)和悬尾测试(Steru et al. 1985)，用于不同的抑郁动物模型，例如遭受慢性轻度压力的啮齿动物(Willner 1997)或FSL大鼠。强迫游泳测试是最广泛使用的行为绝望测试，即动物暴露于不可避免的情况下引起的绝望，它基于啮齿动物会试图逃避厌恶刺激的假设。在测试中，动物处于无法逃脱的压力之下。在最初的挣扎之后，他们会变得动弹不得，类似于一种绝望和精神抑郁的状态。该测试在不同的实验室中简单、可靠，并且已被证明对已知影响人类抑郁症发展的各种因素敏感，包括遗传易感性、食物摄入的变化、睡眠的改变以及以前的压力暴露(Cryan等人，2005年5a, b)。此外，FST具有高度的预测有效性，因为它对所有类型的抗抑郁药治疗都很敏感，包括三环抗抑郁药(TCA)，单胺氧化酶抑制剂(MAOI)，选择性5 -羟色胺再摄取抑制剂(SSRIs)，去肾上腺素再摄取抑制剂(NRIs)， NMDA拮抗剂和电休克治疗(Borsini和Meli 1988;Berman et al. 2000;Zarata等人，2006;Petryshen et al. 2016;Khakpai et al. 2019)。因此，有人认为这种行为模式与临床抑郁症引发的一些行为之间存在功能关系(Lucki et al. 2001)。然而，在评估类抑郁行为时，考虑只使用一种行为模型(FST)的局限性也很重要(Reardon et al. 2019)。补充行为模型，如蔗糖偏好测试，可以在未来的研究中为这些化合物的作用提供更多有价值的信息。
本研究的一个有趣发现是，在小鼠和弗林德斯敏感系大鼠(FSL)的Porsolt强迫游泳测试中，静止不动的时间减少了，这显示出对环境压力源的遗传易感性，并已成功用于抗抑郁效果的验证(Overstreet et al. 2005)。有趣的是，与对照组相比，急性和慢性给药trk受体、ACD855、ACD856和AC-0026845的阳性变构调节剂(pam)可减少静止时间。考虑到这两种化合物的结构和药理相似性，这种作用可能是由TrkB受体的激活介导的，因为AC-0026845的抗抑郁作用被预先施用选择性TrkB受体拮抗剂ANA-12阻断。在这种情况下，值得注意的是，我们之前已经表明，ACD855和ACD856的促认知作用也被ANA-12阻断(Dahlstr?m等人，2021)，这表明TrkB是这类化合物的两种体内作用的关键介质。在我们的实验中，我们没有观察到ANA-12本身的任何抗抑郁作用，正如之前一些其他研究报道的那样(Cazorla et al. 2011;Zhang et al. 2014)。根据局部显微注射研究，有人认为激动剂和拮抗剂的抗抑郁作用部位不同(Zhang et al. 2014)。虽然刺激海马和前额皮质中的TrkB具有抗抑郁作用，但阻断伏隔核中的TrkB也具有抗抑郁作用。这些研究与我们的实验之间的差异可能与使用的剂量以及随后阻断伏隔核trkb受体所需的ANA-12暴露有关。事实上，在我们的实验中，随着ANA-12剂量的增加，固定时间开始减少，尽管没有达到显著性。
选择性5 -羟色胺再摄取抑制剂(SSRI)氟西汀和n-甲基- d -天冬氨酸(NMDA)谷氨酸受体的非竞争性拮抗剂氯胺酮减少了静止时间，这与先前的研究一致(Detke和Lucki 1996;Maeng, et al. 2008;Koike, et al. 2011)。小鼠和大鼠对选择性5-羟色胺再摄取阻滞剂氟西汀的反应差异可能是由于对大脑中5-羟色胺传输的物种/菌株特异性反应。在一项研究中，研究了急性氟西汀对大鼠和小鼠焦虑、应激性热疗的生理测量的影响(Conley和Hutson 2007)，急性氟西汀引起了明显的物种特异性效应。因此，在小鼠中，应激性热疗和活动不受氟西汀的影响。相反，在大鼠中，氟西汀在没有压力的情况下引起明显的基线低体温，混淆了进一步的解释。此外，氟西汀在小鼠和大鼠体内的药代动力学和药效学的细微差异也可能是一个影响因素(Anelli et al. 1992)。
与早期的一些研究一致，本研究的结果还表明，氯胺酮和氟西汀的作用至少部分是由BDNF/TrkB途径介导的，因为氯胺酮和氟西汀的抗抑郁样作用(即减少FST中不动时间)被选择性TrkB受体拮抗剂ANA-12预处理显著阻断。此外，亚阈值剂量的TrkB PAM AC-0026845与氯胺酮或氟西汀联合使用可诱导显著的加性或协同效应，这表明可能存在相互或关联的途径以及可能的联合治疗方案。
多项证据表明，脑源性神经营养因子(BDNF)、其特异性受体TrkB和随后的雷帕霉素复合物1 (mTORC1)信号传导的哺乳动物靶点在重度抑郁症(MDD)的病理生理以及抗抑郁药的治疗机制中发挥着重要作用(Nestler等人，2002;Hashimoto et al. 2004;Duman and Monttegia 2006;Martinowich et al. 2007;桥本2010;Castren 2014;Lindholm and Castren 2014, Casarotto et al. 2021)。在抑郁症的习得性无助模型中，将BDNF单次注入海马的齿状回(DG)和CA3锥体细胞层会产生持久的抗抑郁作用(Shirayama et al. 2002)。一种病毒介导的基因转移方法发现，DG中的BDNF可能对调节抗抑郁药的治疗效果至关重要(Adachi et al. 2008)。另一项研究表明，携带人类BDNF Val66Met多态性的杂合BDNF+/Met小鼠在应激后表现出前额皮质(PFC) BDNF水平和顶端树突脊柱密度下降，从而导致抑郁样行为(Yu et al. 2012)。此外，前脑BDNF的缺失会减弱抗抑郁药的作用(Monteggia et al. 2004)，在脑BDNF水平降低或TrkB信号抑制的小鼠中，抗抑郁药引发的反应也会消失(Saarelainen et al. 2003;Monteggia et al. 2007)。这些发现表明，脑BDNF在海马体和前皮层产生类似抗抑郁的作用(Nestler et al. 2002;Shirayama et al. 2002;Duman and Monteggia 2006)。因此，在强迫游泳试验中观察到的Trk-PAM化合物对小鼠抑郁样行为的有益作用可能与BDNF/TrkB通路的激活有关，而BDNF/TrkB通路已被认为在重度抑郁症中发挥重要作用。
虽然在FST中施用不同Trk-PAM化合物后，有几种机制可能导致静止时间(被认为是抗抑郁样活性的指标)的减少，但一种看似合理的机制是BDNF介导的信号传导的增强或增强，我们的研究结果证实了这一发现，即用选择性TrkB受体拮抗剂ANA-12预处理小鼠完全阻断了抗抑郁样活性。
FST中BDNF/TrkB信号的不同正变构调节剂的抗抑郁样作用背后的另一个机制可能与BDNF与吲哚胺、5-羟色胺(5-HT)和/或单胺、去甲肾上腺素和多巴胺系统的潜在相互作用有关。抑郁症的单胺理论指出，抑郁症与突触间隙中单胺水平的降低有关。与抑郁症有关的主要神经递质系统是血清素、去甲肾上腺素和多巴胺能系统(Mongeau et al. 1997;Harro and Oreland 2001)。然而，谷氨酸能系统在抑郁症中的参与也被强烈提出(Duman和Aghajanian 2012;Mathew et al. 2012;Dolgin 2013;Browne and Lucki 2013)。我们的研究结果表明，在FST中，BDNF、血清素和谷氨酸系统之间存在显著的相互作用。非竞争性NMDA受体拮抗剂氯胺酮和选择性5 -羟色胺再摄取抑制剂氟西汀在FST中的固定时间明显短于对照小鼠，可能部分由BDNF/TrkB信号通路介导，因为氯胺酮和氟西汀的抗抑郁样作用被选择性TrkB受体拮抗剂ANA-12阻断。此外，与对照组、氟西汀和AC-0026845治疗组相比，非有效剂量Trk-PAM、AC-0026845与氯胺酮或氟西汀联合用药可诱导显著的加性或协同效应(不活动时间显著减少)。此外，体内微透析数据显示，ACD856能够显著提高自由活动大鼠腹侧海马中血清素水平，而去甲肾上腺素和多巴胺的影响较小(图8)。
血清素在抑郁症中的作用是众所周知的。包括选择性血清素再摄取抑制剂(SSRIs)在内的抗抑郁药已被广泛用作重度抑郁症的治疗药物，尽管多达三分之二的患者对初始治疗没有反应。有趣的是，据报道，长期服用SSRIs可增加海马和前额皮质(PFC)中的BDNF水平(Hashimoto et al. 2004;Duman and Monteggia 2006;Martinowich et al. 2007;桥本2010;Duman和Aghajanian 2012)，这表明BDNF/TrkB信号是治疗性抗抑郁作用的一部分。此外，TrkB受体在中隔核区域表达(Madhav et al. 2001)， BDNF控制发育中的5 -羟色胺神经元的存活和维持(Galter and Unsicker 2000)。先前的研究表明，中游区域神经元(血清素能神经元)中TrkB受体的缺失会导致抗抑郁疗效的丧失和攻击性的增强(Adachi et al. 2017)。
考虑到谷氨酸在重度抑郁症病理生理中的新作用(Sanacora et al. 2008;桥本2009;Zarate et al. 2010;Krystal et al. 2013)，似乎谷氨酸系统是FST中出现抑郁样行为的组成部分。有趣的是，据报道，NMDA受体拮抗剂氯胺酮通过增加BDNF水平显示出快速的抗抑郁作用(Autry et al. 2011)，这表明BDNF- trkb信号在氯胺酮的快速抗抑郁反应中起作用。最近，Casarotto报道氯胺酮与TrkB直接结合，BDNF信号的变构促进是抗抑郁作用的常见机制，这可以解释为什么典型的抗抑郁药作用缓慢，以及抗抑郁药的分子效应如何转化为临床情绪恢复(Casarotto et al. 2021)。因此，BDNF信号与谷氨酸能和/或血清素能系统之间的潜在相互作用可能对FST中抗抑郁样行为的发展至关重要，尽管需要进一步的详细研究来证实这一点。
我们之前报道过Trk-PAM化合物如ACD856对认知的积极作用。认知功能障碍也是重度抑郁症症状学的一个组成部分。目前，沃替西汀是一种对血清素能系统有广泛作用的化合物，是唯一被批准的治疗重度抑郁症的药物，在多个领域显示出积极的认知效果(Perini et al. 2019)。因此，Trk-PAM化合物如ACD856可能为MDD的多种受影响功能提供新的治疗途径。
总之，我们的研究表明，在Trk-PAM的相同结构系列中，几种不同的化合物具有抗抑郁活性。BDNF/TrkB信号与谷氨酸能和/或血清素能系统之间的潜在相互作用似乎也可能调节抑郁相关行为。因此，Trk-PAM可能为重度抑郁症的治疗提供一种新的治疗方式。
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