C9orf72基因非编码区G4C2六核苷酸重复扩增是家族性肌萎缩性侧索硬化症(ALS)和额颞叶痴呆(FTD)的最常见原因。G4C2插入长度是可变的，患者可携带多达数千个重复序列。从G4C2转录本翻译的二肽重复蛋白(DPRs)被认为是毒性的主要驱动因素。在相对较短DPRs的模式生物中进行的实验表明，富含精氨酸的DPRs毒性最大，而聚甘氨酸-丙氨酸(GA)的DPRs毒性较小。然而，GA是患者大脑中最丰富的DPR，动物实验工作通常依赖于使用低重复次数，DPR通常被标记用于体内跟踪。重复长度或标记是否影响GA的毒性还没有系统的评估。因此，我们在成年神经元中产生特异性表达GA100、GA200或GA400的果蝇系。与以往的研究一致，GA100和GA200的表达仅引起轻度毒性。相反，GA400的神经元表达大大降低了果蝇的攀爬能力和存活率，表明长GA DPRs在体内可能具有高毒性。这种毒性可以通过标记GA400来消除。对果蝇大脑的蛋白质组学分析显示，GA400对大脑蛋白质组具有重复长度依赖性的调节，与较短的GA蛋白相比，GA400引起的变化更早、更强。PolyGA表达上调内质网到高尔基体转运的相关蛋白，下调胰岛素信号传导相关蛋白。实验下调Tango1 (ER-to - Golgi转运的高度保守调节分子)可部分挽救GA400毒性，提示该过程的错误调控有助于polyGA毒性。在实验中，增加胰岛素信号也可以挽救GA毒性。总之，我们的数据表明，长polyGA蛋白在体内可能具有高毒性，因此它们可能有助于患者的ALS/FTD发病机制。

　　肌萎缩性侧索硬化症(ALS)是一种以运动神经元丧失为特征的致命性成人发病神经退行性疾病[1]，而额颞叶痴呆(FTD)的临床特征是由于额叶和颞叶的神经损伤而导致人格、行为和语言的改变[2]。这两种证候在病理和遗传水平上重叠，并可在患者和家庭中同时发生[1]。9号染色体开放阅读框72 (C9orf72)中的内含子G4C2己核苷酸重复扩增(HREs)是家族性ALS和FTD的最常见原因[3,4]。在C9orf72突变携带者中，G4C2重复序列的数量从几十个到几百个或几千个不等[5,6]，在个体之间[7]，在同一个体的不同组织[8-10]和年龄[11]中存在显著差异。尽管人们努力改善HREs的大小[12,13]，但重复长度与疾病发病或严重程度的相关性得出了相互矛盾的结论[8,11,14]。HREs在正义和反义方向上转录[3,15,16]，并通过重复相关的非aug (RAN)翻译产生5种不同的二肽重复蛋白(DPRs)[17,18]:聚(甘氨酸-丙氨酸)(polyGA)、聚(甘氨酸-脯氨酸)(polyGP)、聚(甘氨酸-精氨酸)(polyGR)、聚(脯氨酸-丙氨酸)(polyPA)和聚(脯氨酸-精氨酸)(polyypr)。HREs导致人类ALS/FTD的确切机制尚不清楚。虽然有几个因素可能导致发病，包括C9ORF72蛋白的功能丧失和G4C2转录物的积累，但DPRs的表达被认为是毒性的关键驱动因素。针对C9-ALS/FTD患者设计的几种治疗方法目前正在临床试验中进行测试，但仍然没有可用的疾病改善疗法[19]。因此，在临床前模型中广泛研究了DPR毒性的机制，以开发新的治疗策略。

　　对模式生物的研究表明，聚gp和聚ypa不会引起毒性。相反，含有精氨酸的DPR，即polyGR和polyypr，对神经元的表达具有极大的毒性，被认为是毒性最大的DPR物种[20-25]。PolyGR和polyypr可以作为细胞质和核包裹体检测[26-28]，并与核糖体和rna结合蛋白相互作用[29,30]。关于含有精氨酸的DPRs如何诱导毒性，已经提出了几种机制，包括抑制蛋白质翻译[31,32]，胁迫颗粒动力学功能障碍[31,33]，核功能障碍[34,35]和核胞浆运输中断[22,23,36,37]。

　　虽然在标准重复长度下，它的毒性比含有精氨酸的DPR要小，但GA是患者组织中最丰富的DPR[38,39]，用GA特异性抗体治疗可以强烈改善表达人类C9orf72等位基因的小鼠的行为缺陷，这些基因有450个G4C2重复序列[40]。尽管存在一些争议[21,41]，polyGA的表达也被证明在从苍蝇到哺乳动物等生物中诱导毒性[20,26,27,42 - 46]。只有少数研究讨论了较长DPRs的影响。在果蝇中，gfp标记的GA1000的神经元表达不影响果蝇的寿命[41]。然而，由于本研究中没有未标记的GA1000构建物，因此不能排除gfp标签的混杂效应。polyGA如何引起毒性仍未完全了解。PolyGA与蛋白酶体[47]和自噬相关蛋白，如p62[29, 38, 45, 48]和含缬素蛋白(VCP)[29]相互作用。此外，GA表达可引起DNA损伤[49]，损害核胞浆运输[50]，降低突触活性[51]。有趣的是，GA在哺乳动物细胞培养物[52-56]和果蝇神经元[57]中特别容易在细胞间传播。

　　重复长度可影响DPR的行为和毒性。细菌人工染色体(BAC)-C9小鼠G4C2重复长度、DPR积累水平与毒性呈正相关[58]。GA的传播潜力依赖于重复序列的长度，GA200在果蝇大脑中比GA100更容易传播[57]，尽管GA的传播是否导致其毒性尚不清楚。虽然人类DPRs的真实长度尚不清楚，但RAN翻译更倾向于更长的重复序列[59,60]。此外，实验证据表明，G4C2 HRE上游的特定内含子序列调节了DPR翻译的启动[60,61,62,63,64]，而人类DPR包含一个c端区域[65]，这表明G4C2 RAN翻译一旦启动，可能会正常进行，因此人类DPR可能反映了生成它们的HRE的长度[66]。

　　本研究以果蝇为模型，研究了重复长度对多聚甘油三酯毒性的影响。我们在成年果蝇神经元中产生了表达GA100、GA200和GA400的果蝇系。polyGA的聚集倾向和亚细胞定位受重复序列长度的强烈影响。GA100和GA200的表达对成虫的发育无不良影响，但对成虫的攀爬能力和成虫存活率有轻微影响。GA400的表达显著降低了成虫的幼虫活力、攀爬能力和成虫存活率，表明GA400具有较高的体内毒性。值得注意的是，用绿色荧光蛋白(GFP)或mCherry标记的GA400没有诱导毒性，这可能解释了为什么以前的研究未能检测到长polyGA DPRs表达的毒性。出乎意料的是，表达GA100的果蝇比表达ga200的果蝇寿命短。因此，通过神经元清除机制，GA200扩散倾向的增加可能有助于其毒性降低。通过对GA100、GA200和GA400短、中期和长期表达后果蝇大脑的蛋白质组学分析，我们发现了一组独立于重复长度的polyGA调控的核心蛋白，以及每个重复长度特异性的蛋白变化。与高毒性一致，GA400诱导的蛋白质组变化更早、更强。最后，胰岛素信号的激活和通过下调Transport和高尔基体组织1 (Tango1)来减少er -高尔基转移都部分地挽救了GA400的毒性，这表明这两条途径应该在哺乳动物长polyGA模型中进一步探索。

　　果蝇种群被喂食糖/酵母/琼脂(SYA)饲料[67]，并在12:12 h的明暗循环中保持65%的湿度。将雌性Gal4驱动蝇与野生型(WT)雄蝇杂交。实验采用可诱导的泛神经元elav-GeneSwitch (elav-GS)驱动装置，将果蝇置于25°C环境下，控制幼虫密度饲养48 h。将实验果蝇分类到含有200 μM RU486(米非司酮)溶解于乙醇(EtOH)的SYA食物中。在诱导构建体表达8小时的实验中，果蝇被分类到仅含etoh的食物中24小时，之后它们被转移到RU486食物中8小时。用于处理GA跨细胞传播的果蝇表达温度敏感(ts) Gal4抑制剂Gal80ts，以减少发育过程中UAS转基因的表达。该抑制剂在18°C时具有活性，可通过将果蝇移至29°C来抑制激活Gal4活性[90]。因此，用于处理跨细胞传播的果蝇发育成熟，并在18°C下交配两天，之后将雌性果蝇分类为SYA食物，并在29°C下维持指定时间。除非另有说明，否则将雌性果蝇用于实验，并将其保存在塑料瓶中，密度为每瓶15只果蝇用于表型分析、蛋白质组学分析和脑染色实验，或每瓶20只果蝇用于mRNA或蛋白质分离。除未回交的UAS-Hsp22 RNAi和UAS-Hsp83 RNAi外，所有转基因蝇系都至少回交6代进入远交系WT白色Dahomey[68]。以下转基因果蝇系来自Bloomington Drosophila Stock Center:dilp3-Gal4 (BDSC_52660)、GMR-Gal4 (BDSC_9146)、UAS-Hsp22 RNAi (BDSC_51397)、uas - hsp_83 RNAi (BDSC_33947)、uas -胰岛素受体(InR)组成型活性(InRActive) (BDSC_8263)、orco-Gal4 (BDSC_23292)、pkr样ER激酶(PERK)e01744突变等位基因(BDSC_85557)、UAS-p62 RNAi #1 (BDSC_33978)、UAS-p62 RNAi #2 (BDSC_36111)、UAS-Sec22 RNAi (BDSC_34893)、UAS-shibire温度敏感显性阴性(shitsDN) (BDSC_44222)、UAS-Tango1 RNAi (BDSC_67886)、tubulin-Gal80ts (BDSC_7019)和was - hunc -119- ha表达(BDSC_82223)。UAS-UNC-119 RNAi细胞系(#19653)从维也纳果蝇资源中心获得。UAS-ATG5-RNAi和UAS-ATG1过表达(OE) (GS10797)系来自京都果蝇遗传资源中心[69,70]。elav-GS驱动系是herv

　　Tricoire博士(法国国家科学研究中心)的慷慨馈赠[71]。UAS-p62 OE系是Samantha Loh博士(MRC毒理学单位，英国)赠送的慷慨礼物[72]。以前报道过UAS-RPN6 OE线[73]。此前也报道了attP40站点的UAS-GR100和UAS-PR100[20]系，以及attP2站点的UAS-GA100和UAS-GA200系[57]。

　　为了生成pUAST atb - ga400 -stop质粒，由Eurofins Genomics (Germany)合成pMK-RQ质粒，该质粒含有编码200个GA重复序列的DNA序列，其5 '侧为一个smi限制性内切位点(RS)， 3 '侧为一个XbaI限制性内切位点(S-GA200-X)。S-GA200-X质粒和我们之前描述的EcoRI-ATG-GA100-SmaI-XbaI-GA100-Stop-NotI pBluescript SK(+)质粒[57]都用SmaI和XbaI限制性内切酶(New England Biolabs)酶切。根据制造商的说明，将结扎反应转化为NEB Stable Competent大肠杆菌(New England Biolabs)。该序列经测序进一步验证(Eurofins Genomics)。将GA400序列亚克隆到pUAST atb表达载体的EcoRI和NotI酶切位点，转化到NEB Stable Competent大肠杆菌中，进行扩增和测序。

　　为了生成pUAST attB- ga400 - mcherry和pUAST attB- ga400 - gfp质粒，我们将S-GA200-X质粒和我们之前描述的ecori - atg - ga100 - smai - xbaii - ga100 - noti pBluescript SK(+)质粒[57]进行酶切、连接、扩增并亚克隆到pUAST attB表达载体上，从而形成一个不含停止密码子的pUAST attB- ga400 - not质粒。用EcoRI和NotI酶切该质粒和pUAST- mcherry - c载体[57]，形成pUAST attB-GA400-mCherry载体。对于pUAST atb - ga400 -GFP质粒，我们使用引物JOL124和JOL125以及融合聚合酶(NEB)对GFP进行pcr扩增。引物序列见表1。这导致在GFP的n端增加了NotI RS和连接子GGTAGTGGAAGTGGTAGT，在停止密码子后增加了c端KpnI RS。该连接子编码3xGlycine-serine (Gly-Ser)，用于pUAST attB-GA400-mCherry和pUAST attB-GA400-GFP质粒[57]。在消化GFP扩增子后，将其连接到pUAST- attB载体上，形成pUAST-GFP- c质粒。使用相同的策略生成pUAST atb - ga400 - gfp载体。

　　表1引物列表

　　以引物SOL565和SOL566为引物，以cDNA RE07468为模板(Drosophila Genomics Resource Center)对RPN11 ORF进行PCR扩增，利用引物中的NotI和XbaI酶切位点将RPN11 ORF克隆到pUAST attB载体中，构建果蝇RPN11条件表达的转基因蝇群。为了达到高表达水平，所有构建体在ATG起始密码子之前都包含一个CACC Kozak序列。所有质粒的序列通过Sanger测序(Eurofins Genomics)进行验证。利用phic31介导的attP/attB位点定向整合将构建物插入果蝇基因组[74]。将pUAST attB-GA100-stop、pUAST attB-GA200-stop和pUAST attB-GA400-stop插入到attP40(第II染色体)和attP2(第III染色体)位点。由BestGene果蝇胚胎注射服务公司将pUAST attB-GA400-mCherry和pUAST attB-GA400-GFP注射到attP2位点。结构示意图见附加文件1:图S1A和附加文件7:图S7A。有关构造的完整长度序列，请参阅附加文件14。将pUAST的attB-RPN11质粒插入attP40位点(染色体II)。

　　采用DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen)提取3只成年雌性果蝇的基因组DNA进行基因分型。每个样品取10 ng DNA，用引物JOL36和JOL37和TaKaRa LA Taq聚合酶对UAS转基因进行PCR扩增。一半扩增反应随后在Cut Smart 10X酶切缓冲液(NEB)中用XbaI(未标记GA400)或XbaI和NotI(标记GA400)在37°C下酶切30分钟，另一半只与酶切缓冲液在相同条件下混合，不加限制性内切酶。PCR产物用2%琼脂糖凝胶分离。

　　5只未交配的GMR-Gal4雌性与5只UAS或WT雄性交配2天，然后转移到实验瓶中产卵5小时，计数卵和闭合蝇数。卵对成虫的存活率是通过将成虫数量除以卵的数量来计算的。每个基因型使用7-10个重复。

　　五种纯GMR-Gal4、GMR-Gal4;was - ga100或GMR-Gal4;将UAS- ga400雌性与5只UAS或WT雄性交配2天，然后转移到实验小瓶中产卵24小时。后代在25°C下发育并闭合。雌蝇或雄蝇羽化后2 d，使用配备电动台和多焦点工具的徕卡M165 FC立体显微镜(徕卡应用套件软件)对眼睛进行成像。所有眼睛图像在相同的放大倍率下获得。使用ImageJ从10到13只苍蝇计算眼睛面积，除非少于10只苍蝇关闭。在我们的遗传小屏幕中，GMR-Gal4对照、单独表达GA400或GA400与调节剂组合的果蝇的眼睛大小差异采用单因素方差分析+ Dunnet多重校正检验进行统计学检验。

　　在泛神经元elav-GS驱动下，将雌蝇按15只/瓶的密度分装到含有200μM RU486的SYA培养基中，诱导UAS转基因表达。如果没有特别说明，每个条件测试了10个独立的生物重复(即每个基因型n=150只雌性苍蝇)。每隔2-3天将苍蝇放入新鲜的小瓶中，同时记录死亡情况。数据显示为累积生存曲线。

　　阴性地向性试验如前所述[75]进行。简单地说，将雌性果蝇放入塑料管中驯化30分钟，之后将果蝇转移到六室逆流装置的1室[76]。然后把苍蝇拍到瓶子的底部，让它们爬上瓶子20秒。在这段时间之后，苍蝇被转移到一个新的房间，之后苍蝇再次被拍下来。这样重复了四次。具有攀爬能力的苍蝇必须攀爬至少15厘米的距离。爬升指数是根据六个小瓶中每个小瓶中的苍蝇数量计算的。每种条件下，每管15只蝇，生物重复3次。

　　根据制造商的说明，使用Trizol (Invitrogen)从雌性果蝇的头部提取总RNA。RNA用DNase I (ThermoFisher)处理，RNA浓度用Qubit BR RNA测定(ThermoFisher)测定。根据制造商的说明，使用Superscript III第一链合成试剂盒(Invitrogen)和oligodT引物从600 ng总RNA中生成cDNA。采用PowerUp SYBR Green Master Mix (ThermoFisher)在QuantStudio7 (ThermoFisher)上进行Q-RT-PCR。以Rpl32为归一化对照，采用?ΔCT法计算基因的相对表达量(折叠诱导)。

　　将20只雌性成虫蝇头匀浆于100μl添加了不含EDTA蛋白酶抑制剂(Roche)和PhosStop磷酸酶抑制剂(Roche)的Complete mini的冰冷RIPA中，并在冰上孵育30分钟，偶有涡流。样品在4℃下13000 g离心15分钟，取上清液。每个样品15μl在任意kd无染色标准凝胶(Biored)上分离，随后转移到0.45μm硝化纤维素膜(GE Healthcare)上。通过将膜暴露在紫外线下对蛋白质负载进行成像。随后用5%脱脂奶粉在室温下封闭膜1小时，并在4℃下与小鼠抗ga(克隆5E9) (1:1000;默克Millipore, AB_2728663)和兔anti-Ref(2)P/p62 (1:1000;Abcam，目录#178440)。在TBST中洗涤三次后，用酶标抗小鼠(1:10 000,ThermoFischer, AB_2536527)或抗兔(1:10 000,ThermoFischer, AB_2536530)二抗在RT下探针1小时，使用ECL化学发光试剂盒(GE Healthcare)进行检测。ImageJ随后用于波段强度量化。

　　在PBS中解剖成年雌蝇的大脑，立即用4%多聚甲醛在4°C下固定2小时。在PBS中用0.5% Triton X-100 (PBT)在RT下清洗大脑，在PBT中用5%胎牛血清和0.01%叠氮化钠在RT下阻断1小时，然后用小鼠单克隆抗ga (1:3000;默克Millipore (AB_2728663)或兔多克隆抗裂解caspase 3 (CC3) (1:500;Cell Signaling, AB_2341188)抗体，4°C过夜。RT下PBT洗涤后，用Alexa633山羊抗小鼠(ThermoFischer, AB_2535718)或Alexa488山羊抗兔(ThermoFischer，目录号A11008)在4°C下以1:100稀释孵育过夜。最后，在PBT中洗涤脑，在甘油- pbs中孵育，并在含有DAPI的vectasshield抗褪色贴装培养基中贴装(Vectorlabs，目录#H-1200)。

　　采用徕卡SP8-DLS或SP8X共聚焦显微镜，在全脑范围内拍摄了一系列2 μm的z-stack。在给定实验的所有基因型中使用相同的共聚焦设置。使用20倍或60倍的物镜对大脑进行成像。利用ImageJ中z-stacks的最大强度投影，对成年果蝇大脑中央区域的GA水平进行了量化。在测量GA扩散的实验中，使用20倍物镜拍摄全脑共聚焦图像，然后使用ImageJ进行处理，然后进行量化分析。首先，获得最大的z堆叠投影，以识别光学叶周围的层，以及从堆叠中裁剪出来的不同伪影。此外，如前所述[57]，初始表达诱导区域也被移除。使用图像分析软件Imaris 9.2.0(牛津仪器公司)从裁剪的z堆栈中进行三维定量分析剩余脑区的GA点。背景校正后，使用内置的光斑检测算法识别最小尺寸为1500 nm的光斑。检测设置根据斑点的最大强度进行调整，这证明了最准确的过滤器，可以区分强烈标记的斑点(被认为是真正的GA斑点)和来自气管或背景的弱/低质量斑点。在同一实验中比较的所有条件使用相同的参数。

　　为了评估cc3阳性细胞的变化，使用图像分析软件Imaris 9.2.0对整个堆栈进行3D量化。背景校正后，使用内置的光斑检测算法识别最小尺寸为3000 nm的光斑，并根据光斑的最大强度进行设置调整。在同一实验中比较的所有条件使用相同的参数。

　　研究人员对25只被解剖的成年果蝇的大脑进行了4次生物重复，分别来自年轻(第5天)、中年(第15天)和老年(第40天)雌性果蝇。简单地说，脑样品在95°C的裂解缓冲液中变性10分钟，缓冲液中含有6 M氯化胍、2.5 mM TCEP、10 mM氯乙酰胺和100 mM Tris-HCl。每个重复收集25个成人大脑，每个基因型和年龄使用4个重复。裂解液样品进一步用Bioruptor plus (Diagenode)超声处理，超声30秒，间歇30秒，持续10个周期。在20,000 g离心20分钟后，将蛋白上清转移到新管中，用20 mM Tris和胰蛋白酶(trypsin Gold, Promega， #V5280, 1:20 00 w/w)稀释10倍，在37°C下消化过夜。然后加入终浓度为1%的甲酸(FA)停止反应。肽段用定制的C18-SD (Empore) StageTips清洗。用甲醇和40%乙腈(ACN)/0.1% FA润湿，最后用0.1% FA平衡。stagetip用0.1% FA洗涤两次，肽段用40% ACN/0.1% FA洗脱，然后在45°C的Speed-Vac (Eppendorf)中干燥45分钟。第5天和第15天的样品一起处理，第40天的样品分别处理。

　　洗脱后的肽4μg在0.1 M三乙基碳酸氢钠(TEAB)中重悬。TMTpro 16plex (ThermoFisher， #A44522)标签根据制造商的说明进行以下更改:将0.5 mg TMT试剂与33μL无水ACN重新悬浮。将ACN中7μL的TMT试剂加入到0.1 M TEAB中9μL的清洁肽中。最终ACN浓度为43.75%，多肽与TMTpro试剂的比例为1:20。第5、15和40天的所有16个样品在每个时间点的一个批次中进行tmt标记。孵育60 min后，用2μL 5%羟胺猝灭反应。将标记的肽池，干燥，在0.1% FA中重新悬浮，分成两等份，并使用自制的STAGE尖端脱盐。样品在1 mm × 150 mm, 130 ?， 1.7μm ACQUITY UPLC Peptide CSH C18色谱柱(Waters， #186006935)上进行分离，使用Ultimate 3000 UHPLC (ThermoFisher)。肽以30μL/min的流速分离，以88 min的分段梯度从1到50%缓冲液B分离85 min，从50%到95%缓冲液B分离3 min;缓冲液A为5% ACN, 10 mM碳酸氢铵(ABC)，缓冲液B为80% ACN, 10 mM ABC。每三分钟收集一次馏分，将馏分分成两道(1 + 17,2 + 18等)并在Speed-Vac (Eppendorf)中干燥。

　　干燥的馏分在0.1% FA中重新悬浮，在50 cm, 0.075 mm的Acclaim PepMap 100 C18高效液相色谱柱(ThermoFisher， #164942)上分离，并在配备FAIMS装置(ThermoFisher)的Orbitrap Lumos Tribrid质谱仪(ThermoFisher)上进行分析，该装置在?50 V和?70 V两种补偿电压下工作。基于MS3的同步前体选择用于TMT报告离子信号的测量。用EASYnLC1200从6%到31%的缓冲液用90分钟线性梯度分离多肽;缓冲液A为0.1%

　　FA，缓冲液B为0.1% FA, 80% ACN。分析柱在50°C下操作。使用Proteome Discoverer(版本2.4.1.15)分析果蝇脑蛋白质组学数据。同位素纯度校正因子，由制造商提供，包括在分析中。

　　通过保留被多个独特肽识别的蛋白质来去除污染物。原始肽强度值进行log2和z转换。通过将每个肽的z强度与log2转换数据的全局标准差相乘，并将log2转换数据的全局平均值相加，对结果进行了重新缩放。只有在每个处理的四个重复中至少三个重复中检测到的蛋白质才被考虑用于下游分析。这些是通过使用其他重复的平均值来推算的。使用r中的limma软件包(版本3.46)进行差异表达分析，使用limma软件包从规范化数据中去除不同解剖时间点的批处理效果。采用R包factoextra(1.0.7)进行主成分分析。检测两个蛋白质数据集之间指示的重叠的概率使用Fisher的精确检验进行了测试。

　　GO信息从R中的org. dm . egg .db包(版本3.13.0)中检索，GO富集使用R包Clusterprofiler(3.18.1)使用生物过程本体完成。所有在数据集中表达的蛋白都被用作背景。使用R包rrvgo(1.2.0)和阈值“0.7”来减少GO术语冗余。利用超几何检验检验富集分析的统计学显著性，用Bonferroni多重校正检验校正P值。

　　使用GraphPad Prism或RStudio 4.0.4版本进行统计分析。个别统计检验显示在图例中。对于寿命以外参数的多重比较检验，采用单向和双向方差分析。两组比较采用Bonferroni事后检验。当两组以上进行比较时，使用Tukey-Kramer检验。使用RStudio 4.0.4版本进行相同治疗的不同基因型的寿命比较。两两比较采用log-rank和Bonferroni多重检验校正进行评估。P值< 0.05被认为是重要的:* P < 0.05, * * * * * P < 0.01, P < 0.001, * * * * P < 0.0001。

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